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DNA连串决定了纤维素的纤维素系列,那使得5mC在

2019-09-18 23:05
维生素C参与产生一种全新的DNA修饰

表观遗传的魔力

10月1日,国际学术期刊Nucleic Acids Research 在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心丁建平研究组的最新研究成果:Molecular basis for the substrate specificity and catalytic mechanism of thymine-7-hydroxylase in fungi,该研究工作揭示了真菌胸腺嘧啶水解酶T7H底物特异性的分子基础和催化机制。

徐彦辉等《自然》揭示TET蛋白底物偏好性机制

5月2日,国际权威学术期刊《自然》在线发表了来自中科院上海生物化学与细胞生物学研究所徐国良院士联合复旦大学唐惠儒教授和中科院武汉水生生物研究所黄开耀研究员等多个课题组合作完成的研究成果“A vitamin-C-derived DNA modification catalysed by an algal TET homologue”。该研究首次在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)这种单细胞真核生物中鉴定到一种新型的TET同源蛋白,并发现该蛋白可以将维生素C的碳基骨架转移到DNA上,产生一种全新的DNA修饰。文章详细阐述了维生素C直接参与该DNA修饰的反应机理,并揭示这一蛋白及其产生的DNA修饰在调节莱茵衣藻光合作用过程中的重要作用。

自从DNA双螺旋结构被解析以及中心法则的提出,人们已经认识到DNA作为遗传物质的重要性。以人类为例,DNA序列决定了蛋白质的氨基酸序列,并最终导致不同生命个体之间的差异。那么问题来了, DNA序列完全一致的细胞是否就完全相同呢?

DNA胞嘧啶的甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在很多生物学过程中发挥重要作用,属于双加氧酶家族的TET蛋白参与了DNA的主动去甲基化过程。哺乳动物中TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶到5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的多步氧化反应,该催化过程与真菌中胸腺嘧啶水解酶T7H催化的从胸腺嘧啶到5-羟甲基尿嘧啶、5-醛基尿嘧啶和5-羧基尿嘧啶的多步氧化反应过程在化学特性上存在很多相似之处,且TET和T7H均为双加氧酶超家族成员。虽然TET蛋白与包含5mC修饰碱基的DNA复合物的晶体结构已经被报道,但TET蛋白识别和区分胞嘧啶C5位不同修饰基团以及催化5mC发生连续氧化反应的分子机制仍不清楚。因此,研究T7H的底物特异性识别和催化机制可以增进对TET蛋白结构和功能的理解。

本报10月29日上海讯今天,国际顶级学术期刊《自然》在线发表了复旦大学生物医学研究院徐彦辉教授课题组的论文。该项研究成果揭示了TET蛋白底物偏好性机制,对研究多种疾病的发病机制,尤其对血液肿瘤治疗性药物开发有重大意义。

徐国良研究组长期致力于DNA修饰酶和新修饰的发现工作,对哺乳动物DNA去甲基化过程中产生的DNA修饰及其生物学功能进行了深入研究。在真核生物中,DNA修饰的最主要形式是5-甲基胞嘧啶。

答案自然是否定的。

丁建平研究组的博士研究生李文婧等人解析了真菌Neurospora crassa来源的胸腺嘧啶水解酶T7H的原酶形式、辅因子a-KG结合形式以及不同底物结合形式(结合a-KG和T、5hmU或5fU)的高分辨率的晶体结构。结构和生化分析结果表明,T7H只能在辅因子存在的情况下结合底物,且不同底物的结合不会导致活性位点发生显著构象变化。活性位点的氨基酸残基Phe292、Tyr217和Arg190在底物结合、催化反应过程中发挥重要作用。T7H与不同底物之间略有差异的亲和力和催化活性受到底物C5位修饰基团与辅因子和蛋白之间相互作用的影响。催化反应结束后,产物被首先释放,然后新的辅因子和底物结合到T7H的活性位点开始新的氧化反应。此外,T7H与TET蛋白的结构比较阐明了T7H催化游离碱基而非DNA中修饰碱基的结构基础。这些研究成果揭示了T7H底物特异性的分子基础和催化机制,并为TET蛋白底物特异性的分子基础和催化机制提供了新的见解。

这篇题为“晶体结构揭示TET蛋白介导的氧化反应底物偏好性机制”的研究论文,首次报道了TET蛋白对三种DNA甲基化衍生物不同催化活性的分子机制,为基因组中5-羟甲基胞嘧啶相对稳定存在提供了分子水平的解释。该论文是徐彦辉课题组在DNA甲基化领域作出的又一突破性成果。组长徐彦辉为复旦大学生物医学研究院研究员,复旦大学附属肿瘤医院兼职教授。该课题组曾于2013年在《细胞》杂志报道TET蛋白的三维结构,于2015年初在《自然》杂志报道DNA甲基化建立的机制研究(参考徐彦辉课题组网站,

近年来,包括徐国良研究组在内的三个实验室发现TET双加氧酶可以将5mC依次氧化产生5-羟甲基胞嘧啶 、5-醛基胞嘧啶 、5-羧基胞嘧啶 。后两种修饰经由胸腺嘧啶DNA糖苷酶耦联的碱基切除修复或DNA复制等途径从基因组上被移除,完成DNA去甲基化过程。但有关TET双加氧酶在进化过程中的保守性,以及其在低等生物中的酶活与功能还有待进一步探索。

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上海同步辐射光源17U线站和国家蛋白质科学研究设施19U线站在实验数据收集中提供了支持与帮助。该项研究工作得到了国家科技部、国家自然科学基金委和中国科学院的经费支持。

据悉,人体基因组DNA是生命遗传信息的基本载体,生命延续和繁衍需要DNA上的一种“甲基化修饰”。“甲基化修饰”具有调控人体内特定基因的表达和决定细胞命运的作用,可使细胞发生程序化的改变。哺乳动物基因组的胞嘧啶上会产生甲基化修饰,称为5-甲基胞嘧啶(5mC, 即第5种碱基)。而TET蛋白是哺乳动物细胞中的一种氧化酶,可以执行DNA去甲基化功能。近期研究发现,TET蛋白在去甲基化过程中,将5mC氧化为5hmC (5-羟甲基胞嘧啶,第6种碱基)后,可继续催化5-hmC转化为5-fC(5-醛基胞嘧啶,第7种碱基)和5-caC(5-羧基胞嘧啶,第8种碱基)。其中,5hmC在细胞内相对稳定存在,且其含量远远高于5fC和5caC。但这一现象一直没有合理的生物学解释。徐彦辉课题组综合利用结构生物学,生物化学和计算生物学等研究方法,揭开了这一谜底。

在最新发表的工作中,研究者以莱茵衣藻作为模式生物,鉴定到了8个TET同源蛋白。通过蛋白纯化以及酶活分析,他们发现其中的CrTET1 可以将DNA上的5mC转变为两种不同的修饰碱基,CrTET1也因此被重新命名为CMD1 (5-methylcytosine modification enzyme 1)。进一步的研究表明,这两种新修饰都是在5mC的甲基碳上增加了一个甘油基,二者由于空间结构的差异而互为立体异构体,因此将其统一命名为5-甘油基-甲基胞嘧啶。

图片来源于网络

徐彦辉课题组的生化实验表明,TET蛋白对5mC具备很高活性,而对5hmC和5fC的活性很低。TET蛋白就如同连续的三个扶梯,在转化不同碱基的情况下,其转化速度明显不同,导致产生较多的5hmC和少量的5fC及5caC 。结构研究发现,5mC在TET蛋白催化口袋中的取向使得它很容易被催化活性中心俘获并被氧化为5hmC。5hmC和5fC由于已经有氧的存在,其在催化口袋中被限制住,不容易发生进一步的氧化反应,导致TET蛋白对这两种碱基活性降低。在这样的催化能力差异下,TET会很顺利将5mC产生5hmC,一旦5hmC产生,TET将不容易使其进一步氧化为5fC和5caC,导致细胞内5hmC相对稳定,并且其含量远远高于5fC和5caC。在特定的基因中区域,TET蛋白可能被特定的调控因子激活,会跨越能垒阻碍产生高活性的TET,连续氧化为5fC和5caC。这使得5mC在TET蛋白催化下更容易被氧化为5hmC。这一发现解决了困扰表观遗传学领域的一个难题,也为揭示其他蛋白质逐步催化反应的分子机制提供了新思路和新方法。

这也是除了目前已知的5mC、5hmC、5fC、5caC、6mA、5hmU和base J以外,在真核生物中发现的第8种DNA碱基修饰。更加意外的是,在研究5gmC上甘油基的来源时,研究者发现在传统双加氧酶反应中所必需的α-酮戊二酸在CMD1酶催化反应中可有可无,取而代之的是另一个十分重要的小分子:维生素C。维生素C不仅通过提供电子参与CMD1的催化过程,还直接将自身的甘油基团转移到5mC的甲基碳上,形成新的DNA修饰。研究者进一步解析了CMD1催化5mC与维生素C反应的化学机理,证实乙醛酸与二氧化碳为反应的副产物,从而揭示了一条全新的酶催化途径。通过在莱茵衣藻中开发高效的基因编辑方法,研究者获得了CMD1基因突变藻株。

我们每个人都是从受精卵发育而来,理论上身体的每一部分都共享着相同的DNA序列,但我们体内的细胞类型、组织和器官却大相径庭,而决定这种差异的最主要原因就在于它们拥有完全不同的“表观遗传”信息。

据悉,该项工作是由复旦大学徐彦辉课题组与中国科学院上海药物所罗成课题组合作完成的,徐彦辉课题组的胡璐璐博士和程净东博士,以及罗成课题组的卢俊彦博士是该项工作的主要完成人。该项研究的结构数据是在中科院上海光源BL-17U,国家蛋白质科学中心BL-19U等线站上采集。

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